765.隐蔽、狡猾、善变

    【最近在忙新书，还有本职工作，所以修改会慢一点，大家可以等完本再看】

    放疗(rt)是肺癌必不可少的治疗方式。对于不适合手术的iiia和iiib期肺癌患者，根治性放化疗是治疗标准，这一点已被广泛接受。不幸的是，放疗后肿瘤的再生长是成功控制疾病的主要障碍。

    临床前研究表明，放疗对原发部位和转移部位的肿瘤免疫微环境具有双重作用。一方面，局部照射有可能激活针对远离照射区域的肿瘤细胞的全身免疫反应，即远隔效应，由mole在1953年首次报道。rt促进肿瘤抗原从垂死的肿瘤细胞中释放，上调mhci类表达，并增加多种细胞因子和免疫效应分子的表达，包括白细胞介素(il)-1、细胞间粘附分子1(icam1)和血管细胞粘附分子1(vcam1)，所有这些都有助于由辐射引发的持久和全身抗肿瘤免疫。另一方面，放疗促进了肿瘤细胞的免疫逃避。例如，rt上调多种免疫抑制细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、il-6、il-10和转化生长因子-β(tgf-β)。rt促进免疫抑制细胞的积累，例如肿瘤相关巨噬细胞(tam)、调节性t(treg)细胞和髓源性抑制细胞(mdsc)。辐射增强免疫检查点的活性，如程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)/pd-l1、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla4)、t细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域的蛋白3(tim3)，和淋巴细胞激活基因3(lag3)。

    为了克服放疗的免疫抑制作用，已经提出并测试了免疫疗法和放疗的各种组合。在pacific研究中，标准放化疗后加入durvalumab可延长iii期nsclc患者的无进展生存期和总生存期。pacific研究的巨大成功不仅改变了iii期非小细胞肺癌的临床指南，也引起了其他免疫疗法与rt结合的极大兴趣。

    mdscs的积累和激活在免疫抑制的建立中起关键作用。rt对mdscs的确切影响是复杂的。大分割照射(20gy)抑制mdscs的积累和浸润，而较低剂量的照射往往会促进mdscs募集到肿瘤中。此外，临床前和临床研究表明，胃肠道肿瘤，包括结直肠癌和肝癌，在放疗后相对容易出现mdscs水平降低，而在其他肿瘤模型和临床环境中，如胶质瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部鳞癌、前列腺癌和宫颈癌，导致mdsc数量持续增加。蔡等人首次报道mdscs的pd-l1表达被辐照上调。然而，关于mdscs的确切作用，尤其是其潜在机制，在辐照后塑造tme方面知之甚少。

    mdscs是一组具有强大免疫抑制能力的异质髓细胞。根据表型和形态，mdscs又可分为多形核mdscs(pmn-mdscs，又称粒细胞型mdscs)和单核型mdscs(m-mdscs)。

    免疫抑制活性是mdscs的关键标志。mdscs的抑制机制包括诱导型一氧化氮合酶(inos)、精氨酸酶1(arg1)和吲哚胺2，3-双加氧酶(ido)的表达，以及一氧化氮(no)和活性氧(ros)的产生。这些不同的机制不会同时起作用。人们普遍认为pmn-mdscs和m-mdscs通过不同的机制调控tme。此外，pd-l1的上调也被认为是辐射招募mdscs的免疫抑制机制之一。目前，对于辐照诱导的mdscs对tme的影响及放疗的治疗效果尚无一致的结论。

    磷酸二酯酶-5(pde5)抑制剂，如西地那非和他达拉非，可以阻断环磷酸鸟苷(cgmp)的水解。最新数据表明，pde5抑制剂能够通过抑制荷瘤(tb)小鼠和患者mdsc中inos和arg1的活性和表达来促进抗肿瘤免疫。然而，pde5抑制剂如何影响mdsc的亚群以及rt和pde5抑制剂的组合是否会延迟辐射后的肿瘤再生尚未得到测试。

    我们最近的研究表明，消除招募的mdsc会延迟放疗后路易斯肺癌(llc)的再生。在这里，我们报告了局部照射通过促进pmn-mdsc的增殖及其随后向tme的募集而削弱了抗肿瘤免疫力。arg1的上调和激活是照射后pmn-mdscs介导的t细胞抑制的主要机制。西地那非与放疗的组合通过抑制arg1过表达和pmn-mdsc募集消除了辐射衍生的免疫抑制。

    在tb小鼠和癌症患者中，mdscs随着肿瘤的生长而扩增。mdscs的两个亚群之间的比例取决于特定的肿瘤模型和微环境。为了监测同源llc模型中mdsc的丰度，我们通过免疫表型分析确定了接种后肿瘤的生长以及llc小鼠中不同时间点的总体mdsc及其亚群。

    如图1c所示，肿瘤组织中总mdscs的百分比随着肿瘤的发展而稳步增加，从接种后第一周肿瘤浸润淋巴细胞的不到10%（5.84±1.22%）上升到第四周超过20%（21.71±3.22%）（p<0.01）。在我们的llc模型中，pmn-mdscs占总mdscs的94.94±8.47%，并且与总mdscs具有相同的肿瘤发展趋势（p<0.05）。对亚群进行分析，虽然m-mdscs增加了大约5倍，但差异没有统计学意义。

    为了更好地了解mdscs的全身分布，我们还研究了mdscs在外周血、脾脏和骨髓中的比例。仅在接种llc细胞一周后，tb小鼠外周血中的mdsc百分比是无瘤小鼠的两倍(27.33±4.62%vs.12.48±0.93%，p<0.05)，3周后的mdsc百分比是无瘤小鼠的5倍(27.33±4.62%vs.12.48±0.93%，p<0.05)。tb小鼠外周血中pmn-mdscs的比例也增加，而m-mdscs的比例与肿瘤大小无关。

    pd-l1是肿瘤细胞、mdscs、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。为了确定tb小鼠mdscs的pd-l1表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了mdscs的pd-l1表达。结果表明，tme中mdscs上pd-l1的平均荧光强度（mfi）从在llc细胞接种后的第一周386.8±100.9a.u逐渐增加到第四周的1，068.0±121.8a.u（p<0.01），这表明pd-l1在我们模型中的mdsc中具有潜在作用。

    在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，mdscs的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的mdscs相同。此外，我们在tb小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的mdscs在脾内聚集一致。

    为了确定局部照射对肿瘤生长和mdscs的影响，当肿瘤直径达到7.5mm时，我们使用大分割rt(20gy/f)治疗皮下llc肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为500mm3，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的cd11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是cd11b 髓系细胞，这表明局部照射可能导致mdscs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总mdscs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润mdscs的比例比未治疗肿瘤高2倍(ctrlvs.rt=21.33±3.29%vs.44.10±3.00%，p<0.001)。pmn-mdscs与总mdscs具有相同的增加趋势(ctrlvs.rt=16.37±2.47%vs.38.66±4.24%，p<0.001)，而m-mdsc比例保持在约0.1%，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。

    为了确定受照射肿瘤中pmn-mdsc的逐渐积累是否有助于llc肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗ly-6g单克隆抗体来消耗mdsc.抗ly-6g抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中pmn-mdsc的频率（p<0.05）。此外，用抗ly-6g抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明pmn-mdsc的募集对肿瘤再生至关重要。

    虽然pmn-mdscs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对cd8 t细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定rt后pmn-mdscs诱导的免疫抑制是否依赖于cd8 t细胞，我们通过流式细胞术评估了cd8 t细胞的数量和功能。

    如图3d所示，cd8 t细胞的百分比随着照射从11.71±2.31%下降到2.42±0.62%(p<0.01)。pmn-mdsc耗竭逆转了这种下降（rtvs.rt anti-ly-6g抗体=2.42±0.62%vs.20.12±3.92%，p<0.01）。为了更好地了解cd8 t细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了cd8 t细胞内部和表面上ifn-γ、cd28和pd-1的表达。局部rt显着降低了cd8 t细胞分泌ifn-γ的比例，从33.064.53%降至13.252.08%，并增加了表达pd-1的cd8 t细胞的比例（ctrlvs.rt=253.20±57.03auvs.538.80±98.76）au，p<0.05）。

    cd28表达未观察到显着变化。当抗ly-6g抗体被给予辐照小鼠时，ifn-γ分泌达到与未处理的llc小鼠相同的水平（29.74±3.55%），而与辐照小鼠进行比较抗ly-6g抗体处理后的pd-1表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议pmn-mdscs通过抑制cd8 t细胞促进放疗后肿瘤的再生。pmn-mdscs不仅抑制了tme中cd8 t细胞的数量，而且还抑制了其活性。

    为了确定辐照诱导mdscs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及inos和arg1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部rt增强了arg1的表达，但没有增强inos的表达。arg1活性测定表明，局部照射显著提高了arg1的活性，从0.400.15u/l提高到3.780.39u/l((p<0.01)。相比之下，no荧光标记的inos活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。

    pd-l1的表达是mdscs的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问pd-l1上调是否是rt后mdscs介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后mdsc中pd-l1的表达。图4e显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的mdsc中的pd-l1表达在照射后不久显着增加（照射后第三天：ctrlvs.rt=443.9±175.3auvs.1328.0±324.3au，p<0.05）.然而，此后pd-l1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（ctrlvs.rt=1，465.0±399.6auvs.407.5±164.8au，p<0.05）。外周血中mdscs的pd-l1表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。

    以上数据表明arg1表达的上调是照射后pmn-mdscs抑制功能的合理机制。然而，不涉及pd-l1和inos的调节。为了进一步证实这一假设，在辐射后通过灌胃给予arg1抑制剂nor-noha。10mg/kg/dnor-noha有效地将arg1活性从3.780.39u/l降低到2.020.25u/l（p<0.01）。

    rt后给予nor-noha显着增加cd8 t细胞比例（rtvs.rt nor-noha=2.420.62%vs.6.140.64，p<0.01），并伴有肿瘤再生延迟。inos抑制剂1400w对肿瘤再生长没有影响。

    我们的结果表明，rt通过上调肿瘤内pmn-mdsc的百分比和arg1活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制pmn-mdscs及其arg1活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明，pde5抑制剂可以抑制tb小鼠和癌症患者mdsc中inos和arg1的活性和表达。因此，通过灌胃给予西地那非20mg/kg/d，以研究它是否可以促进rt的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5b所示，正如我们预期的那样，西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长，这与阳性对照nor-noha相当。tme的免疫特征表明，当给予西地那非时，肿瘤内pmn-mdsc的比例从38.66±4.24%下降到23.57±2.38%。

    此外，西地那非也显着降低了arg1的表达。为了进一步检查西地那非对mdsc的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强，我们分析了肿瘤内cd8 t细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明cd8 t细胞的百分比从2.42±0.62%增加到7.21±1.22%。

    此外，当给予西地那非时，cd8 t细胞分泌的ifn-γ也显着升高。因此，我们证实pde5抑制剂西地那非通过调节pmn-mdscs改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。

    工作揭示了pmn-mdscs中arg1通路介导rt后肿瘤再生的新机制，如图6所示。我们认为，pmn-mdscs是辐照招募的主要亚型，而不是m-mdscs。在广泛的免疫抑制机制中，arg1的上调和激活是pmn-mdscs在放疗后抑制cd8 t细胞的主要机制。为了克服pmn-mdscs引起的免疫抑制，我们提出并证明，sildenafil和rt联合使用降低了pmn-mdscs在tme内的募集和免疫抑制作用，激活了cd8 t细胞应答，导致肿瘤生长延迟。综上所述，我们的研究结果为缓解免疫抑制tme以提高rt治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在llc小鼠模型中进行的，但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外，在不同的辐射方案下，mdscs及其亚型如何影响tme仍未确定。因此，这些问题还需要进一步的研究来解决。